PhD細(xì)胞破壁機(jī)-昆蟲細(xì)胞
應(yīng)用背景
又稱昆蟲桿狀病毒系統(tǒng)（Baculovirus expression vector system，BEVS），屬于真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，更接近哺乳動物細(xì)胞的表達(dá)系統(tǒng)，但不同于酵母和哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。昆蟲表達(dá)系統(tǒng)憑借其穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)體系、高表達(dá)水平及翻譯后修飾功能而被普遍認(rèn)可為一種表達(dá)大規(guī)模蛋白的強(qiáng)有力的工具,可以提供高活性的重組蛋白，解決在其它體系中無法解決的蛋白活性困難。昆蟲表達(dá)系統(tǒng)由于其具有高效的表達(dá)能力，通過BEVS得到的重組病毒易于篩選、具有翻譯后修飾功能、表達(dá)外源基因的效率較高。BEVS還可以同時表達(dá)多個外源基因，在分泌蛋白生物活性的同時增加產(chǎn)量。因此，BEVS在科研和工業(yè)生產(chǎn)中通常應(yīng)用于大規(guī)模重組蛋白的制備。應(yīng)用的菌株有sf9、sf21、High-5等。
重組蛋白
通過轉(zhuǎn)座作用將轉(zhuǎn)移載體中的表達(dá)組件定點(diǎn)轉(zhuǎn)座到能在大腸桿菌中繁殖的桿狀病毒穿梭載體上，通過抗性和藍(lán)白斑篩選到重組穿梭質(zhì)粒，提取穿梭質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞后，得到的子代病毒即為重組病毒。將病毒上清浸染昆蟲細(xì)胞，獲得表達(dá)的重組蛋白。
應(yīng)用優(yōu)勢
大蛋白正確折疊、具有真核翻譯后修飾、毒性蛋白可被表達(dá)。適用于病毒疫苗、信號分子、細(xì)胞因子、激酶等。用于生產(chǎn)具有哺乳動物細(xì)胞末端唾液酸化修飾的N糖蛋白。
應(yīng)用方案
通過高壓細(xì)胞破碎儀使物料在柱塞作用下進(jìn)入可調(diào)節(jié)壓力大小的閥組中經(jīng)過特定寬度的限流縫隙均質(zhì)區(qū)在均質(zhì)閥內(nèi)產(chǎn)生三種效應(yīng):空穴效應(yīng)、撞擊效應(yīng)、剪切效應(yīng)的機(jī)械作用力從而打破細(xì)胞壁的束縛，把蛋白質(zhì)從組織或細(xì)胞中釋放出來盡可能保持原來的天然狀態(tài)，不喪失活性，達(dá)到高效率破碎細(xì)胞的效果。即使用高壓勻漿破碎法采用高壓細(xì)胞破碎法，在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的壓力效應(yīng)，從而能夠有效地提取出蛋白質(zhì)，且處理量大、破碎速度較快。這是一種機(jī)械處理細(xì)胞，物理抽提方法。
解決方案
首先富集菌體，收集胞內(nèi)產(chǎn)物的細(xì)胞或菌體。然后進(jìn)行細(xì)胞重懸，用適當(dāng)?shù)木彌_液或培養(yǎng)液將離心或沉降等方法得到的固體（沉淀、細(xì)胞、活性物質(zhì)等等）重新懸浮。其次進(jìn)行細(xì)胞破碎，使產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到液相中。最后收集含生化物質(zhì)的液相，進(jìn)行碎片分離，分離除去細(xì)胞、菌體、細(xì)胞碎片、蛋白質(zhì)的沉淀物和絮凝體等固體懸浮物，得到上清液或?yàn)V液。然后從澄清的濾液中提取胞內(nèi)產(chǎn)物，從細(xì)胞裂解物中獲取目標(biāo)產(chǎn)物。
技術(shù)優(yōu)勢
均質(zhì)閥體終身保修
密封無O型圈或墊片，金屬結(jié)構(gòu)連接
細(xì)胞破碎率≥97%
內(nèi)置和外置雙向控溫
所有機(jī)型均可實(shí)現(xiàn)SIP和CIP
HMI系統(tǒng)，工控自動化
高效細(xì)胞破碎率
減少破碎次數(shù)要求
滿足多種細(xì)胞破碎要求
更高的蛋白質(zhì)獲得率
穩(wěn)定的破碎能力
微通道高壓型結(jié)構(gòu)導(dǎo)致極佳的效果重現(xiàn)性
微通道高壓型結(jié)構(gòu)可線性放大研發(fā)工藝結(jié)果
技術(shù)工藝
破壁工藝：PhD高壓均質(zhì)處理
溫控要求：10℃以內(nèi)
破壁難點(diǎn)：菌濃較高，此菌液破壁條件未知
破壁結(jié)果：破壁率獲得用戶認(rèn)可
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